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SD大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞,使用方法

更新時(shí)間:2019-08-22   點(diǎn)擊次數(shù):1787次
  SD大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞,使用方法;
 
  1、您收到細(xì)胞后,請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作:
 
  取出25cm2培養(yǎng)瓶,75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶,拆下封口膜,放入37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置3-4小時(shí)以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài),然后換用新鮮*培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)或進(jìn)行傳代。
 
  2、細(xì)胞傳代:
 
  1)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞一次;
 
  2)添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化,再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心5min;
 
  3)棄上清,沉淀細(xì)胞用12ml*培養(yǎng)基重懸,然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代,后放入37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
 
  4)待細(xì)胞*貼壁后,觀察培養(yǎng)結(jié)果,之后進(jìn)行換液培養(yǎng)或傳代。
 
  3、細(xì)胞凍存:
 
  1)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí),棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液,用PBS清洗細(xì)胞一次;
 
  2)添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中,倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞回縮變圓后加入*培養(yǎng)液終止消化,輕輕吹打細(xì)胞使之脫落,然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,1000rpm離心5min;
 
  3)用適量的凍存液(FBS:DMSO=9 :1)重懸細(xì)胞,并放置于凍存管中;
 
  4)先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃ 1.5h,然后將其移入-80℃過夜,24h后轉(zhuǎn)入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。
 
  4、細(xì)胞復(fù)蘇:
 
  1)從液氮中取出細(xì)胞凍存管(注意:佩戴防爆管面具),快速將其置入37℃水浴中解凍,直至凍存管中無結(jié)晶,然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁;
 
  2)將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml*培養(yǎng)基的15ml離心管中, 1000rpm離心5min;
 
  3)棄上清,沉淀用5ml*培養(yǎng)基重懸,接種25cm2培養(yǎng)瓶,于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);
 
  4)第二天,換用新鮮*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
 
  SD大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞,細(xì)胞傳代:收到細(xì)胞后,請(qǐng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶外表進(jìn)行消毒,將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行 1-2 小時(shí)的緩沖,待細(xì)胞恢復(fù)基本生長(zhǎng)狀態(tài)后,進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。在倒置顯微鏡下觀察整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況:
 
  (一)細(xì)胞未長(zhǎng)至 85%時(shí),用 75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到生物操作臺(tái)內(nèi),嚴(yán)格無菌操作,打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶,若培養(yǎng)瓶上無特殊標(biāo)注,吸去剩余培養(yǎng)液,只留 6-8ml 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
 
  (二)細(xì)胞已長(zhǎng)滿(達(dá) 85-95%)。即可進(jìn)行傳代,具體步驟如下:
 
  1.棄去培養(yǎng)液,用 PBS 洗滌 1-2 次,
 
  2.加入 1.0ml 胰酶消化液,37℃消化,顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞回縮變圓、透亮、輕拍甁壁呈流沙樣脫落,則迅速拿回操作臺(tái),加入雙倍的含 10%血清的*培養(yǎng)液,終止消化并輕輕吹打細(xì)胞,使其變成單細(xì)胞懸液,
 
  3.將細(xì)胞收集于離心管中離心 1000rmp/5min,棄上清,輕彈管底,將細(xì)胞彈散,
 
  4.加入新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,進(jìn)行傳代、凍存,
 
  5.如果沒有特別說明,建議收到細(xì)胞后的次傳代比例為 1:2。